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　　摘要：探討不飽和脂肪酸對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)的形態(tài)、增殖、免疫表型及分化潛能的影響。采用0.15%Ⅷ型膠原酶消化法從皮下脂肪組織中分離獲得ADSCs，使用添加了油酸或亞麻酸的培養(yǎng)基對(duì)ADSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，同時(shí)使用特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和染色鑒定，并采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)三系分化誘導(dǎo)培養(yǎng)9d后成脂、成骨及成軟骨相關(guān)標(biāo)志基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，0.15%Ⅷ型膠原酶消化法能獲得形態(tài)均一的ADSCs;培養(yǎng)相同的時(shí)間后，與未添加脂肪酸的空白對(duì)照組相比，含有20μmol/L油酸或亞麻酸的培養(yǎng)體系中所收獲ADSCs的細(xì)胞數(shù)量增加了20%左右;各組細(xì)胞CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈陽性表達(dá)，CD31、CD45呈陰性表達(dá);使用20μmol/L油酸或亞麻酸進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)后，油紅O、茜素紅、阿利新藍(lán)染色呈陽性反應(yīng)，同時(shí)細(xì)胞中的成脂標(biāo)志基因PPAR-γ、成軟骨標(biāo)志基因SOX9和COL2A1及成骨標(biāo)志基因ALP、OCN、RUNX2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明油酸及亞麻酸能夠促進(jìn)ADSCs增殖，維持細(xì)胞的免疫表型且提高細(xì)胞的三系分化潛能。

　　關(guān)鍵詞：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs);不飽和脂肪酸;油酸;亞麻酸;生物學(xué)特性

　　人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)是存在于脂肪組織中的一種多潛能干細(xì)胞，在特定條件下可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞[1]。ADSCs免疫原性低，可減少同種異體間移植的排斥，且具有旁分泌功能，可分泌多種生長(zhǎng)因子及炎性因子[2]，在修復(fù)、替換、維持或增強(qiáng)組織和器官功能等研究領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大的再生醫(yī)學(xué)功能，因此被廣泛應(yīng)用于臨床研究[3]。據(jù)《中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)》網(wǎng)站提供的信息(http://www.cmba.org.cn/common/index.aspx-nodeid=281&pagesize=1&pagenum=10.htm)，截至2020年11月，在國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)備案的干細(xì)胞臨床研究機(jī)構(gòu)增至111家，備案項(xiàng)目達(dá)100個(gè)，其中有5個(gè)臨床研究項(xiàng)目使用的細(xì)胞為ADSCs，包括廣東省中醫(yī)院開展的ADSCs治療中重度尋常型銀屑病的試驗(yàn);上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院開展的異體ADSCs治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床研究;聊城市人民醫(yī)院開展的ADSCs治療中重度潰瘍性結(jié)腸炎及肺動(dòng)脈高壓的臨床研究等。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)ADSCs相關(guān)動(dòng)物及臨床研究證實(shí)，ADSCs具有應(yīng)用于糖尿病足[4]、心肌缺血[5]、腦損傷[6]等修復(fù)治療的潛力。

　　脂肪酸是生物體的供能物質(zhì)和生物膜的重要組成部分，是膳食中重要的能量來源物質(zhì)。脂肪酸根據(jù)飽和程度的不同可分為飽和脂肪酸(saturatedfattyacid,SFA)和不飽和脂肪酸(unsaturatedfattyacid,UFA)，其中不飽和脂肪酸又分為單不飽和脂肪酸(monounsaturatedfattyacid,MUFA)及多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA)[7]。不飽和脂肪酸及其代謝產(chǎn)物是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，因此在干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控方面具備特定的功能。2014年Kang等[8]在StemCells上發(fā)表的綜述中提到，Ω-6和Ω-3族PUFA及其代謝產(chǎn)物與細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能有關(guān)，它們可以通過多種作用機(jī)制，影響不同來源間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的生物學(xué)特性，例如促進(jìn)多種干細(xì)胞的增殖及分化，繼而影響干細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控。目前，關(guān)于PUFA在干細(xì)胞分化中的作用研究主要集中在PUFA來源的代謝產(chǎn)物，包括花生四烯酸(arachidonicacid,AA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)、前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)、白三烯B4(leukotrieneB4,LTB4)、血栓素A2(thromboxaneA2,TXA2)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoicacid,DPA)，而研究的細(xì)胞模型多以神經(jīng)干細(xì)胞為主，對(duì)MSCs的研究較少[8-9]。只有少量研究涉及DHA、EPA和AA等對(duì)人臍帶、骨髓來源MSCs增殖或分化方面的影響[10-11]。三系分化能力是鑒定MSCs的標(biāo)準(zhǔn)之一，已有研究表明脂肪酸能影響體外培養(yǎng)的成肌干細(xì)胞的分化[12]，但目前尚未有研究報(bào)道脂肪酸對(duì)ADSCs三系分化能力的影響。本研究旨在體外分離、培養(yǎng)ADSCs，并應(yīng)用不飽和脂肪酸作用于ADSCs，探究MUFA中的油酸和PUFA中的亞麻酸對(duì)ADSCs形態(tài)、增殖、免疫表型及分化潛能的影響，以期為ADSCs提供更優(yōu)化的培養(yǎng)體系以及為脂肪酸應(yīng)用于MSCs方面提供研究基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1材料脂肪組織取自東莞市第五人民醫(yī)院的志愿者，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水保存。

　　杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco'sphosphate-bufferedsaline,DPBS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline,PBS)、α-MEM(MEMalphabasic)培養(yǎng)基、0.125%胰酶(Gibco公司，美國(guó));人血小板裂解液(Helios公司，美國(guó));Ⅷ型膠原酶(Sigma公司，美國(guó));油酸[>85.0%(SG)]、亞麻酸[>70.0%(SG)](梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司);MSC成脂誘導(dǎo)分化試劑盒、MSC成骨誘導(dǎo)分化試劑盒、MSC軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒、阿利新藍(lán)、油紅O、茜素紅(賽業(yè)生物科技有限公司);青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司);流式單抗PEmouseIgG1κisotypecontrol(PE-ISO，同型對(duì)照)、PEmouseanti-humanCD13、PEmouseanti-humanCD29、PEmouseanti-humanCD44、PEmouseanti-humanCD73、PEmouseanti-humanCD90、PEmouseanti-humanCD105、PEmouseanti-humanCD31、PEmouseanti-humanCD45(BD公司，美國(guó));TriQuickReagent(北京索萊寶科技有限公司);QIAzolLysisReagent(QIAGEN公司，德國(guó));逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa公司，日本);ultrapuredistilledwater(Invitrogen公司，美國(guó));BIOG血清血漿游離RNA提取試劑盒(常州百代生物科技股份有限公司)。

　　1.2ADSCs的分離、培養(yǎng)與傳代

　　取志愿者皮下脂肪組織，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水與脂肪組織充分混勻，400g離心7min后倒出脂肪組織，重復(fù)數(shù)次上述洗滌步驟，直至無明顯血液殘留。按照1∶1體積比加入0.15%Ⅷ型膠原酶溶液，充分混勻后置于37℃水浴鍋中消化30min，期間每隔5min混勻一次。消化完成后400g離心7min，棄上層脂肪，細(xì)胞沉淀重懸于含1%青鏈霉素混合液和5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液用100μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后接種于T-175培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后更換不含青鏈霉素混合液的培養(yǎng)基并除去未貼壁細(xì)胞，之后每隔3d換液，細(xì)胞融合度達(dá)80%后用0.125%胰酶消化2~3min，加入3倍體積的生理鹽水稀釋消化，以1∶3比例傳代，取第3~5代的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)增殖。

　　1.3油酸或亞麻酸誘導(dǎo)ADSCs增殖的最佳濃度篩選

　　油酸、亞麻酸分別使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基稀釋成20μmol/L、40μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L的濃度梯度。將P5代ADSCs以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成2mL含不同濃度脂肪酸的培養(yǎng)基，以不加脂肪酸的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，吸棄舊培養(yǎng)液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，制備單細(xì)胞懸液。使用CounstarIM1200自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率。

　　相關(guān)期刊推薦：《生命科學(xué)研究》主要反映世界各國(guó)生命科學(xué)領(lǐng)域中的最新研究成果，所刊登的論文90%來源于中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家科技部重大項(xiàng)目基金以及省級(jí)科學(xué)基金。本刊主要刊登國(guó)內(nèi)外生命科學(xué)領(lǐng)域中的具有創(chuàng)造性的學(xué)術(shù)論文及少量反映國(guó)內(nèi)外重大進(jìn)展或熱點(diǎn)問題的快訊或綜述性文章，覆蓋的主要學(xué)科是：生物化學(xué)與分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物技術(shù)、遺傳學(xué)、植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、微生物學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)、基因工程、農(nóng)業(yè)工程、病理學(xué)、毒理學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等等。

　　為優(yōu)選最佳的使用濃度，首先設(shè)置大范圍的濃度梯度，得出合適的濃度范圍，再設(shè)置小范圍的濃度梯度來測(cè)定具體的數(shù)值。因此，將油酸、亞麻酸使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)稀釋成10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L的濃度梯度。將P4代ADSCs以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成2mL含不同濃度脂肪酸的培養(yǎng)基，以不加脂肪酸的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h，吸棄舊培養(yǎng)液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后制備單細(xì)胞懸液并進(jìn)行計(jì)數(shù)，比較各組的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率。

　　1.4油酸或亞麻酸對(duì)ADSCs形態(tài)的影響及生長(zhǎng)曲線繪制

　　取5×104個(gè)ADSCs(P3代)接種于10cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成10mL含20μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養(yǎng)基(含5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基)，以不加脂肪酸為空白對(duì)照組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24h在各組中隨機(jī)選擇3個(gè)培養(yǎng)皿，吸棄舊培養(yǎng)液并用生理鹽水清洗1次，吸棄生理鹽水后再加1mL的0.125%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，制備單細(xì)胞懸液，吹打混勻，取20μL細(xì)胞懸液與20μL0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻后加樣到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率(每孔取3個(gè)視野計(jì)數(shù)后取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析)，以時(shí)間為橫軸，總細(xì)胞個(gè)數(shù)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，在顯微鏡下觀察并記錄其形態(tài)是否有差異。

　　1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型

　　取P3代細(xì)胞以4500cm-2的密度接種于T-175培養(yǎng)瓶，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成含20μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以不加脂肪酸為空白對(duì)照組，細(xì)胞融合度達(dá)90%后，取各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的具體步驟如下：收集各組ADSCs并使用1mLPBS重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，將1mL細(xì)胞懸液均分至11個(gè)EP管中，每個(gè)EP管中的細(xì)胞數(shù)量為2.2×105個(gè)，3000r/min離心6min，小心棄上清后再加入25μL的PBS重懸細(xì)胞沉淀，將流式單抗PE-ISO(同型對(duì)照)及CD13、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105對(duì)應(yīng)的抗體各取5μL加入相應(yīng)的EP管中，陰性對(duì)照組加入5μL的DPBS(未染色的細(xì)胞即為陰性對(duì)照)，混勻后4℃冰箱避光孵育30min。孵育終止后，每管加入500μL的PBS洗滌樣品，3000r/min離心6min，小心棄上清。洗滌兩次后加入200μL的PBS重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到流式管中，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況。

　　1.6細(xì)胞三系分化能力檢測(cè)

　　取P3代的ADSCs細(xì)胞以4500cm-2的密度接種于T-175培養(yǎng)瓶，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成含20μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以不加脂肪酸為空白對(duì)照組，細(xì)胞融合度達(dá)90%后，取各組細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)并染色鑒定。

　　成脂分化能力檢測(cè)：取4.5×105個(gè)ADSCs接種到裝有2mLMSC培養(yǎng)基的6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，換成2mLMSC成脂分化培養(yǎng)基A液[含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛];3d后更換為2mL培養(yǎng)基B液(含胰島素及10%FBS);24h后再更換成A液誘導(dǎo)，循環(huán)誘導(dǎo)7d后使用油紅O染液進(jìn)行染色鑒定。

　　成骨分化能力檢測(cè)：取4.5×105個(gè)ADSCs接種到裝有1mLMSC培養(yǎng)基的12孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到基本融合時(shí)，更換1mLMSC成骨分化培養(yǎng)基，每隔2d更換一次MSC成骨分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)14d后使用茜素紅進(jìn)行染色鑒定。

　　成軟骨分化能力檢測(cè)：收集各組細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后取出含有1.0×106個(gè)ADSCs的細(xì)胞懸液，1200r/min離心獲得細(xì)胞沉淀，吸棄上清后加入10μLMSC培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，取5μL細(xì)胞沉淀置于24孔板，以形成細(xì)胞微團(tuán)。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2h后向24孔板中加入1mLMSC成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每隔2d換一次MSC成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)14d后使用阿利新藍(lán)染液進(jìn)行染色鑒定。

　　1.7Q-PCR檢測(cè)成骨、成軟骨及成脂分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)水平

　　取P3代細(xì)胞以4500cm-2的密度接種于T-175培養(yǎng)瓶，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成含20μmol/L油酸或亞麻酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)90%后，取1×106個(gè)細(xì)胞接種到裝有2mL完全培養(yǎng)基的6孔板中，每組重復(fù)2個(gè)孔，培養(yǎng)24h后更換特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)9d后根據(jù)QIAZolLysisReagent說明書分別提取各組ADSCs的總RNA，并用微量分光光度儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，隨后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA作為模板，以GAPDH為內(nèi)參，采用Q-PCR檢測(cè)成脂標(biāo)志基因PPAR-γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γ)、成軟骨標(biāo)志基因SOX9(SRY-relatedprotein9)和COl2A1(typeIIcollagen-A1)以及成骨標(biāo)志基因ALP(alkalinephosphatase)、OCN(osteocalcin)、RUNX2(runt-relatedtranscriptionfactor2)的mRNA表達(dá)水平。上下游引物均是根據(jù)NCBI提供的mRNA序列，使用Primer3Plus軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司最終合成。PCR引物序列見表1。——論文作者：李錦靈，林立龍，李治寰